La coupe Gambardella 1999-2000 est la 46e édition de l'épreuve organisée par la Fédération française de football et ses ligues régionales. La compétition est ouverte aux équipes de football de jeunes dans la catégorie des 18 ans. La compétition comprend une première phase régionale suivi d'une phase nationale comportant huit tours. Le vainqueur de l'édition 1998-1999, l'AJ Auxerre réussit le doublé en battant en finale le LOSC Lille Métropole.